Molecular genetic pamamaraan sa pananaliksik

Upang galugarin at makilala variants sa DNA istraktura na ginagamit molekular genetic pamamaraan. Para sa bawat DNA rehiyon, na kung saan explores ang rehiyon ng kromosoma, gene o allele, ang mga pamamaraan ay naiiba. Napapailalim sa bawat molekular genetic pamamaraan Binubuo ang ilan o iba pang pagmamanipula ng RNA at DNA. Ang lahat ng mga pamamaraan na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang napakalaking kumplikado, nang walang hindi maaaring natupad kondisyon laboratoryo, at ang mga kawani ay dapat na lubos na kwalipikadong. Trabaho na ito ay isinasagawa sa ilang yugto.

yugto

Una, RNA o DNA samples na ginawa. Narito, isang molekular genetic pamamaraan maaaring ilapat sa halos anumang materyal: isang patak ng dugo, leukocytes, fibroblasts kultura, mucosa (scraped), kahit na ang hair follicles, - DNA ay maaaring makuha mula sa anumang sample. Ito ay angkop na gamitin ang anumang molekular genetic pamamaraan at ang kanilang mga iba't ibang mga pagpipilian at may mahabang ihiwalay DNA ay naka-imbak frozen. Ang ikalawang yugto ay nakatuon sa ang akumulasyon ng mga ninanais fragment (amplification) ng DNA, tulad ng ito ay tumutulong na matiyak ang polymerase chain reaction in vitro (in vitro walang paglahok ng mga buhay na organismo). Bilang isang resulta, ang mga napiling DNA fragment multiplies sa pamamagitan ng ito kadena reaksyon, at ang halaga ng DNA nagdaragdag literal milyon-milyong mga beses.

Ang ikatlong hakbang sa molekular pamamaraan genetic pananaliksik ay ipinapalagay pinaraming DNA paghihigpit (ito pagkapira-piraso, pansiwang o cutting). Paghihigpit ginanap sa pamamagitan ng electrophoresis sa isang polyacrylamide o agarose gel. Ito molecular-genetic na paraan ng pag-aaral ng DNA fragment ay nagbibigay-daan sa lahat ng tao na kumuha ng isang tiyak na posisyon sa gel. Pagkatapos noon, ang gel ay itinuturing na may ethidium bromide, na may kakayahang nagbubuklod sa DNA, ang pag-iilaw sa ultraviolet light, pagkatapos ito ay posible upang obserbahan luminescence bahagi. Molecular genetic diagnostic pamamaraan ay iba-iba at marami, ngunit ang unang dalawang hakbang ay pangkaraniwan sa lahat. Ngunit upang kilalanin ang DNA fragment, ang gel ay maaaring may kulay, at maraming iba pang mga umiiral na mga pamamaraan.

uri ng hayop

Ang pinaka-direktang at laganap na mga pamamaraan para sa pag-detect ng mycobacteria ay maaaring isama ang mga nasa itaas na molekular genetic DNA pamamaraan sa pag-aaral. Ang kakanyahan ay na, upang makilala ang pag-scan kadena materyal ng mga tiyak na mga fragment ng DNA ng mga pathogens. Molecular genetic diagnostic pamamaraan ay hindi pa magkaroon ng isang mas mahusay na paraan upang makilala ang naturang sakit tulad ng tuberculosis. Gamit ang polymerase chain reaction (PCR), maaari mong siguraduhin na ang mga orihinal na DNA ay taasan ang bilang ng mga kopya sa isang milyong beses, iyon ay, magkakaroon ng paglaki, at ito ay ipakita ang mga resulta. Ang antas ng sensitivity ay napakataas na - higit sa siyamnapu't limang porsyento, na kung saan ay ang pangunahing bentahe ng ang paraan na ito.

Ang magpahinga ng ang molecular-genetic pamamaraan ng pananaliksik sa ang pagiging epektibo ng ani ng maraming kopya literal Dinoble, dahil sa kasong ito ang pagbalangkas ng sample ay nagpapakita ng isang tiyak na oligonucleotide sequence nadagdagan sa 106 beses. Kahit na ang kultura diyagnosis ng tuberculosis ng respiratory system makabuluhang mas mababa ang sensitivity. Ito ay kung bakit modernong gamot ay batay sa molekular genetic pamamaraan ng diagnosis ng tuberculosis. A inilarawan pamamaraan ay epektibo lalo na kapag pagharap sa mga pathogens ng mataas antigenic pabagu-bago, matukoy na ang ibang paraan ay mas mahirap - ay nangangailangan ng espesyal na pagkaing nakapagpalusog media at paglinang mahabang panahon. Biochemical at molekular genetic pamamaraan makabuo ng napaka-iba't ibang mga epekto sa mga resulta.

diyagnosis ng tuberculosis

Marshall PCR diyagnosis ng tuberculosis pinaka-karaniwang paggamit ng mga pagkakasunud-sunod DNA na partikular para sa lahat ng apat na mga uri ng sakit. Upang makamit ang layuning ito ay madalas na gamitin ang primers na tuklasin ang sequence AY elemento (IS-986, IS-6110), pati na ang mga elementong ito magpakilala na nagpapalipat-lipat species Mycobacterium tuberculosis at palaging kasalukuyan ng maraming kopya sa genome. Gayundin maaaring natupad DNA pagkuha mula sa purong kultura at Klinikal (plema ng mga pasyente) sa pamamagitan ng anumang iba pang mga naaangkop na pamamaraan. Halimbawa, may Boom paraan kung saan ang mga lysis buffer ay ginagamit batay sa guanidine thiocyanate at kwats bilang ang carrier DNA. Ang bilang ng mga pasyente na naiiba mahihirap bacteriological pagtaas ng bawat taon, at samakatuwid ay sa klinikal na kasanayan ay itinatag ng isang ganap na naiibang mga antas ng organisasyon: molecular-genetic na paraan ng pag-aaral ng DNA ay naglalaro ng isang malaking papel sa diagnosis.

Gayunman, kailangan naming umamin na ito ay hindi na walang drawbacks. Ang PCR pamamaraan ay ang paggamit ng mga madalas na nagdudulot ng isang malaking bilang ng mga huwad na-positibong resulta, at ang dahilan ay hindi lamang teknikal na mga error, ngunit din ng mga tampok ng ang paraan mismo. Bilang karagdagan, gamit ang pamamaraan ng diagnosis upang matukoy ang posibilidad na mabuhay ng mycobacteria, na kung saan ay natukoy, ito ay simpleng imposible. Ngunit ito dehado ay hindi ang pinaka-mahalaga. Molecular genetic pamamaraan ng PCR diagnostic nilalagay sa panganib ng kontaminasyon ng mycobacterial DNA. Certification mga kinakailangan para sa kadahilanang iyon para sa PCR laboratoryo na dinisenyo eksklusibo husto, nangangailangan ang mga iyon ng tatlong mga hiwalay na lugar. PCR teknolohiya ay moderno at napaka-kumplikado, ito ay nangangailangan ng paggamit ng naaangkop na kagamitan at mataas na sinanay na tauhan.

bacterioscopy

Kapag ang diagnosis resulta ng pagtatasa ay dapat na kumpara sa iba pang data: klinikal na pagsusuri, radyograpia, pahid mikroskopya, crop at kahit bilang tugon sa isang tiyak na paggamot ay napakahalaga. Sa seryeng ito, ang PCR-aaral ay isa sa mga bahagi lamang. Alamin ang pathogen sa unang bahagi ng diagnosis ay maaaring maging ang pinakamadaling at pinakamabilis na paraan - bacteriological.

May ay ginagamit isang ilaw mikroskopyo (pangkulay Ziehl-Neelsen) at fluorescent (pangkulay fluorochromes). Ang bentahe ay na bilis pahid ang mga resulta. Ngunit ang mga sagabal ay makatarungan isinasaalang-alang ang limitadong kapasidad dahil sa mababang sensitivity. Gayunman, ang paraan na ito ay ibinigay ng WHO na rekomendasyon bilang ang pinaka-matipid at lupa sa tiktikan tuberculosis pasyente. Detection ng mycobacteria bakteryolohiko pamamaraan ay may halaga na hula at tinatayang quantitatively bacterial pawis. Mas may tiwala haharapin ang mga ito molekular genetic pamamaraan sa pananaliksik ng tuberculosis.

kultura

Mas mahusay na pag-detect ng mycobacteria makilala kultural na pag-aaral. Paghahasik pathological materyal na ito ay ginawa sa ang daluyan ng itlog: Mordovsky, Finn II, LJ, at iba pa. Benchmarks ng paglaban ng mycobacteria na gamot at hindi direktang katibayan ng ang pagiging epektibo ng isang bilang ng mycobacteria at ang kanilang mga kolonya sa vitro, kung ang inilapat na paraan ng pananaliksik kultura. Upang dagdagan ang porsyento ng paghihiwalay ng mycobacteria pagbabakuna ng pathological materyal ay gaganapin sa maramihang mga kapaligiran.

Pagtugon sa mga pangangailangan ng maraming mga cultural, pathogen kabilang ang grant at mga likido. Ginamit sa system na ito at automated na sumusukat type Vantes paglago. Pananim ay dapat na gaganapin sa incubation para sa hanggang sa pito hanggang walong linggo. Sa pamamagitan ng oras na ito ang butsi pati ang kakulangan ng paglago ay maaaring ituring na negatibo. Ang pinaka-epektibong paraan upang tuklasin ang Mycobacterium tuberculosis isaalang-alang ang biological samples: diagnostic materyal makahawa Guinea Pig, na kung saan ay lubos na madaling kapitan sa TB.

Ang ilang mga numero

Kagiliw-giliw na larangan ng pag-aaral, na kung saan ay binuksan sa pamamagitan PCR diagnostic ay upang pag-aralan ang M. tuberculosis - tago impeksiyon. Ang modernong konsepto ng TB infection ay nagmumungkahi na sa labas ng isang daang tao na nasa contact na may M. tuberculosis, siyamnapu't maaaring na rin ma-impeksyon, ngunit lamang ng sampung ng mga ito ay aktibong sakit na ay binuo. Ang iba ay may TB kaligtasan sa sakit, at dahil siyamnapung porsiyento ng mga kaso ng impeksyon ay nananatiling tago. Alamin ang isang pattern na ito ay nakatulong sa isang molekular genetic pamamaraan.

Geneticists sabihin na limampu't limang porsiyento ng mga na ang mga pananim pathological materyal ay negatibo, at walong pung porsiyento ng mga taong nahawaan ng M. tuberculosis, ngunit tuluy-tuloy na walang radiographic manifestations ng sakit, PCR positibong tugon na natanggap. Ito ay isang genetic diagnostic pamamaraan ay nakatulong upang makilala ang mga pasyente sa panganib sa pamamagitan ng PCR pag-aaral, na may mga resulta ng kanilang mga pinag-aaralan (mikroskopya at kultura) ay negatibo, at subclinical impeksiyon M. tuberculosis ay kasalukuyan.

modernong pananaliksik

Ang Russian Federation at bakteryolohiko laboratoryo gamitin ang isang pinabilis na pamamaraan ng absolute konsentrasyon: nitrayd reductase aktibidad ng mycobacteria nasubok sa pamamagitan ng Griess pantauli. Anti-TB center gamitin ang isang pamamaraan na nagbibigay-daan upang matukoy gamot panlaban. Ito seeding sa likidong media, kung saan automated radiometric at fluorescent accounting system na paglago ng mycobacteria. Ang ganitong mga isang pagtatasa ay ginagawa nang mabilis - hanggang sa dalawang linggo.

Sa kasalukuyan, ang mga bagong pamamaraan ay binuo: drug pagtutol ng mycobacteria ay sinusukat sa antas genotype. Pag-aaral ng molekular mekanismo ng paglaban gene at nagpapakita ng pagkakaroon in mycobacteria. Ang mga gene ay kaugnay sa pagtutol sa ilang mga gamot. Halimbawa, kasa gene, Inha, katG lumalaban sa isoniazid, rpoB gene - rifampicin 16Sp RNA gene at rpsL - streptomycin, emb1 - upang ethambutol, Gyra - isang fluoroquinolone at iba pa.

mutations

Ang mga modernong diyagnosis makabuluhang tumaas ang molecular-genetic antas ng pamamaraan para sa pag-aaral ng DNA at pinahihintulutan upang magsagawa ng malakihang pag-aaral ng mga mutations sa lahat ng kanilang spectrum. Ngayon alam namin na ang mga pinaka-karaniwang mga mutations sa 516, 526 at 531 codon ang rpoB gene, at nakilala ang paglaban sa iba't-ibang mga gamot. May ay isang buong hanay ng mga pamamaraan para sa pag-type ng mycobacteria gamit hindi lamang tradisyonal na pamamaraan - biochemical, biological at kultural, ngunit din malawak na ginamit modernong molecular genetic diskarte. Mayroon na mayroong mga sapat at ibigay ang tamang paraan ng pagsusuri para sa pag-detect ng monogenic sakit. Sila ay batay sa DNA pag-aaral sa eksaktong lugar ng isang partikular na gene. Ito ay karaniwang isang komplikadong proseso, oras ubos at mahal, ngunit ang data na ibinigay sa pamamagitan ng molekular genetic pag-aaral, ay mas tumpak at nagbibigay-kaalaman kaysa sa data ng lahat ng iba pang mga pinag-aaralan.

Gaano ito ay kilala na ang DNA ay hindi nagbabago para sa buong buhay ng mga organismo na ito ay sa anumang nucleated cell odnakova, at ito ay ginagawang posible upang gawin ang mga pagtatasa ng ganap na lahat ng mga cell ng katawan, sa anumang yugto ng ontogeny. Ang nasirang gene ay maaaring napansin bago ang paglitaw ng unang sintomas sa full-scale clinical sakit, pati na rin sa malusog na heterozygous mga tao, ngunit sa pagkakaroon ng isang pagbago sa gene. Molecular genetic minamana sakit diagnostic pamamaraan payagan ang upang ibunyag nito (direktang diskarte, DNA-diagnostic), pati na rin upang pag-aralan ang paglayo ng sakit sa pamilya na may marker loci DNA (genetic polymorphisms), na kung saan ay malapit na naka-link na may isang nasira gene (ibig sabihin, ang hindi direktang diskarte ng DNA-diagnostic). Direkta o hindi direkta - anumang DNA Diagnostics ay batay sa mga pamamaraan ng pagkilala sa isang mahigpit na tinukoy na bahagi ng DNA ng tao.

direktang pamamaraan

Direktang pamamaraan ng DNA diyagnosis ay kapag ang salarin gene minamana sakit ay kilala, pati na rin na kilala, at mga uri nito mutations. Halimbawa, ang isang angkop na direktang pamamaraan sa isang bilang ng mga sakit. Ito ni Huntington korie (extension CTG-umuulit), phenylketonuria (R408W), cystic fibrosis (delF508, mga pangunahing mutations) at iba pa. Ang pangunahing bentahe ng direktang paraan ay isang wholly-owned diagnostic kawastuhan, at doon ay hindi na kailangan na gawin ang isang DNA analysis ng ang natitirang bahagi ng pamilya. Kung ang isang pagbago sa kaukulang gene ay natagpuan, ang eksaktong ito ay nagpapahintulot aprubahan ng diagnosis ng pagmamana, genotype pagpapasiya para sa natitirang bahagi ng nabibigatan pamilya.

Isa pang bentahe ng direktang diagnosis ay itinuturing na kilalanin ang isang heterozygous carrier ng masamang mutations mula sa kamag-anak at mga magulang na namatay mula sa sakit. Ito ay lalong totoo para sa mga sakit autosomal umuurong. Disadvantages ng direktang pamamaraan din na magagamit. Upang mag-apply ang mga ito, kailangan mong malaman eksakto kung i-localize ang abnormal gene, exon-intron istraktura ng nito spectrum at mutations nito. Hindi lahat ng monogenic sakit sa araw na natanggap ng naturang impormasyon. Informativeness direktang pamamaraan ay hindi maaaring ituring na kumpleto, dahil ang isa at ang parehong gene ay maaaring magkaroon ng isang malaking bilang ng pathological pagbago na nagiging sanhi ng pag-unlad ng mga sakit na namamana.

di-tuwiran pamamaraan

Hindi direktang pamamaraan sa DNA Diagnostics ay ginagamit sa anomang paraan, sa ibang mga kaso, kung ang napinsala gene ay hindi nakilala, ngunit lamang chromosomally, o kung ang linya diagnosis ay hindi ibigay ang resulta (ito ang mangyayari, kung ang gene masalimuot molecular organisasyon o isang malaking lawak, kung may mga isang pulutong pathological mutations). Hindi direktang pamamaraan ginanap sa paghiwalay pagsusuri ng polymorphic marker sa allelic pamilya. Mga Marker na natagpuan sa parehong chromosomal rehiyon o locus ay may malapit na naka-link sa sakit at kumakatawan sa pagtanggal o insertions, point pamalit, umuulit, at ang kanilang polymorphism ay dahil sa iba't ibang mga halaga ng mga cell sa block.

Karamihan maginhawa para sa hindi direktang diagnosis itinuturing microsatellite at minisatellite polymorphisms, na kung saan ay malawak na ipinamamahagi sa genome ng tao. ang kanilang mga halaga na ipinahayag sa mataas na nilalaman ng impormasyon, kung pinsala sa genetic distansya sa pagitan ng marker at ang gene ay hindi masyadong malaki. Sa huli kaso, ang mga pagtatantya katumpakan ay tinutukoy sa isang malaking lawak ang dalas ng recombination sa pagitan ng polymorphic marker at pinsala. Hindi direktang diagnostic pamamaraan magbigay ng ipinag-uutos na paunang hakbang ng allele frequency ng pinag-aralan ng populasyon sa pag-aaral kasama ng mga pasyente at carrier ng mutations, kasama ang mga pangangailangan ng pagtukoy ang posibilidad ng recombination ng nonequilibrium at pagdirikit marker at mutant allele.

ibang mga paraan

Maikling segment ng RNA o DNA, pati na rin single gene visualized sa ilalim ng microscopic pag-aaral ay hindi maaaring maging, samakatuwid, upang makilala ang mga mutations na kailangan ng molekular genetic diagnosis. May isang "Human Genome Project", pati na rin ang iba pang mga advances sa molecular genetics lubos na pinalawak na ang posibilidad ng diyagnosis ng mga sakit na namamana - parehong bago at pagkatapos manganak. Ang mga pamamaraan ay maaaring magbigay ng maagang pagkakatuklas at gumawa ng isang hula poly- at monogenic sakit, na ang debut ay tumatagal ng lugar sa adulthood. Sa kasawiang-palad, dahil sa mga teknikal na kakayahan ng molekular genetic pag-aaral ay minsan lampas sa etikal limitasyon na itinakda na may kaugnayan sa inheritance, lalo na kapag ang diagnosis ay sa pagdadalaga at pagkabata.

Structural at numerical chromosomal abnormalities ay ang pinaka-karaniwang sanhi ng sakit at kanser, at marami malformations. Chromosomal aberrations kailangang ma-kinilala, na kung saan ay mahalaga para sa pamilya pagpapayo - upang masuri ang taya, kasama ang reproductive panganib sa hinaharap pagbubuntis. Ang kromosomang pagtatasa ay ang "gintong standard" ng genetic diagnosis, ngunit ito ay limitado. Tanging ang mga paraan ng molekular genetic pag-aaral ay maaaring makagawa ng higit pa, dahil may ginagamit sa pag-clone teknolohiya batay fluorescent label na may kakayahang ng kanilang mga mataas na sensitivity upang makilala ang banayad na mga pagbabago chromosomal na imposible na matagpuan classical cytogenetic pag-aaral. Mga pamamaraan na ito ay unting pagpapalawak ng aming diagnostic kakayahan, kapag sinuri, ang mga bata na may-unlad kapansanan, mental pagpaparahan, na may maraming iba pang mga sakit na namamana.

napag-alaman

Ito ay napakahalaga para sa sangkatauhan ay ang mga gene istraktura at pag-andar ng kaalaman, mga uri ng pagbabagu-bago, ang kakayahan sa tiktikan minamana sakit na nangyari na may kaugnayan sa pag-unlad ng molecular genetics. pamamaraan nito ay naglalayong ang pag-aaral ng DNA Molekyul - at kapag ito ay normal, at kapag ito ay nasira. Paghahanda ng deoxyribonucleic acid pagkakasunud-sunod ng nucleotides (DNA) ay umaabot sa yugto mula sa pagtanggap ng mga sample upang makilala ang mga indibidwal na mga fragment. Paghihiwalay ng genomic DNA mula sa mga cell, pagbabawal (pansiwang), paglaki (cloning), electrophoresis ng mga fragment (na naghihiwalay ang kanilang mga electric charge at molekular timbang sa pamamagitan ng agarose gel). Identification ng mga tiyak na mga fragment matatagpuan sa ibabaw ng isang discrete guhit.

Pagkatapos pagkuha sa ang kumilos espesyal na mga filter, kung saan ay ipinapasa sa bawat fragment paghahalo ng lahi sa kopya DNA fragment o gawa ng tao radioactive probes ay isang control, na kung saan ay katumbas ng bawat test sample. Kung binago mo ang posisyon o haba kumpara sa probe, kung ang isang bagong fragment o Naglaho - lahat ng ito ay nagmumungkahi na ang pinag-aralan ng gene ay undergone muling pagbubuo sa pagkakasunod-sunod nucleotide. May walong pangunahing mga diskarte ng molekular genetic pag-aaral: sequencing (pagpapasiya ng DNA sequence), polymerase chain reaction (pagtaas sa ang bilang ng mga pagkakasunud-sunod), ang paghahanda ng primers kilala gene, DNA pag-clone, produksyon ng recombinant molecule nagmula protina dahil sa recombinant molecules, ang paglikha ng isang kumpletong hanay (collection library) kopya fragment na nakuha sa pamamagitan ng paggamit paghihigpit.