Pag-ilaw mikroskopya: mga prinsipyo ng ang paraan

Pagsipsip at muling pagpapalabas ng liwanag karagdagang tulagay at organic likido ay ang resulta ng phosphorescence o pag-ilaw. Ang pagkakaiba sa pagitan ng mga phenomena ay ang tagal ng interval sa pagitan ng pagsipsip at paglabas ng liwanag pagkilos ng bagay. Kapag ang pag-ilaw ng mga prosesong nagaganap halos sabay-sabay, habang phosphorescence - na may ilang mga pagkaantala.

makasaysayang impormasyon

Sa 1852, British siyentipiko Stokes, unang inilarawan pag-ilaw. Siya nagpasimula ng isang bagong term bilang isang resulta ng mga eksperimento na may fluorspar, na kung saan naglalabas ng pulang ilaw sa ilalim ng ultraviolet light. Stokes nabanggit ng isang nakawiwiling kababalaghan. Ito ay natagpuan na ang wavelength ng mga fluorescent radiation ay palaging mas mataas kaysa sa daloy ng paggulo liwanag.

Upang kumpirmahin ang teorya sa ika-19 siglo, nagkaroon ng maraming mga eksperimento. Sila ay nagpakita na ang isang iba't ibang mga samples fluoresce ilalim ng impluwensiya ng ultraviolet light. Kabilang sa mga materyales, bukod sa ibang mga bagay, naging crystals, resins, mineral, kloropila, magaspang droga, tulagay compounds, bitamina, mga kuwadro. Ang direktang paggamit ng tina para sa biological pagsubok ay nagsimula lamang noong 1930

Pag-ilaw mikroskopya: paglalarawan

Ang ilan sa mga materyales na ginamit sa unang kalahati ng ika-20 pag-aaral na siglo exhibited mataas pagtitiyak. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Salamat sa pagganap, na kung saan ay hindi maaaring nakakamit sa pamamagitan ng contrasting pamamaraan, ang paraan ng pag-ilaw mikroskopya ay naging isang mahalagang kasangkapan sa biomedical at biological pananaliksik. Pare-parehong mahalagang mga resulta ay natamo, at para sa mga materyales.

? Anong pakinabang ang ginagawa ng paraan ng pag-ilaw mikroskopya? Ang paggamit ng mga bagong materyales ay naging posible at ang pagpili ng mataas na tukoy na cell submicroscopic mga bahagi. Pag-ilaw mikroskopya maaaring tuklasin solong molecules. Ang iba't-ibang ng mga tina-daan sa ang pagkakakilanlan ng maramihang mga item nang sabay-sabay. Sa kabila ng limitadong spatial resolution ng pagdidiprakt limitasyon ng kagamitan, na kung saan, sa turn, ay depende sa tukoy na mga katangian ng sample, ang pagkakakilanlan ng mga molecule sa ibaba sa antas na ito rin ay lubos na posible. Iba't-ibang mga samples pagkatapos ng pag-iilaw exhibit autofluorescence. Kababalaghan na ito ay malawakang ginagamit sa petrology, botanika, ang industriya ng semiconductor.

Mga tampok

Mag-aral tisiyu hayop o pathogens madalas na kumplikado o masyadong mahina o masyadong malakas na unspecific autofluorescence. Gayunman, ang mga halaga sa pag-aaral ay kumukuha pagpapakilala sa mga bahagi ng materyal na nasasabik sa isang tiyak na haba ng daluyong at nagpapalabas ng mga kinakailangang liwanag daloy intensity. Fluorochromes kumilos bilang dyes na may kakayahang malaya naka-attach sa mga istraktura (nakikita o di-nakikita). Kaya mayroon silang isang mataas na selectivity sa target, at ang ani kabuuan.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Pag-ilaw mikroskopya ay malawakang ginagamit dahil ang pagdating ng mga natural at gawa ng tao dyes. Sila ay nagdala ng mga partikular na intensity profile ng mga emission at paggulo at naka-target sa mga tiyak na biological target.

Pagkakakilanlan ng mga indibidwal na molecules

Kadalasan, sa perpektong kondisyon, maaari kang magrehistro ng isang hiwalay na sangkap glow. Para sa, bukod sa iba pang mga bagay, ito ay kinakailangan upang magbigay ng isang sapat na mababa ang ingay ng detektor at ang optical background. Fluorescein Molekyul sa kabiguan dahil sa photobleaching maaari naglalabas ng hanggang 300 libo. Photons. Sa 20% collection kahusayan ng proseso at maaaring magparehistro ang mga ito sa isang halaga ng tungkol sa 60 thousand.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Pag-ilaw mikroskopya batay sa avalanche photodiodes o electronic pagpaparami, pinapayagan ang mga mananaliksik upang obserbahan ang pag-uugali ng mga indibidwal na molecules sa pamamagitan ng pangalawa, at sa ilang mga kaso kahit na ilang minuto.

kaguluhan

Ang isang pangunahing isyu pabor sa pagpigil ng optical ingay sa background. Dahil sa ang katunayan na ang marami sa mga materyales na ginamit sa ang disenyo ng mga filter at lenses eksibit ang ilang autofluorescence, ang mga pagsisikap ng mga siyentipiko sa maagang yugto ay nakatuon sa ang produksyon ng mga sangkap pagkakaroon ng isang mababang-ilaw. Gayunman, ang mga kasunod na mga eksperimento na humantong sa mga bagong konklusyon. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Sa partikular, ito ay natagpuan na pag-ilaw mikroskopya, batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni, ay nagbibigay-daan ito upang makamit ang isang mababang background at mataas na intensity paggulo liwanag.

mekanismo

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Ang mga prinsipyo ng pag-ilaw mikroskopya, batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni ay ang paggamit ng unti-unting nawawala wave o unti-unting nawawala. Ito ay nangyayari sa hangganan sa pagitan ng media na may iba't ibang repraktibo mga indeks. Sa kasong ito, ang liwanag beam pass sa pamamagitan ng prisma. Ito ay may isang mataas na repraktibo parameter index.

Ang prism katabi ng isang may tubig solusyon o glass na may mababang parameter. Kung ang isang sinag ng liwanag nakadirekta sa ito sa isang anggulo na ay mas kritikal, ang ngiti ay ganap na masasalamin mula sa interface. pangkaraniwang bagay na ito, in turn, nagiging sanhi nonpropagating waves. Sa ibang salita, ang nabuong electromagnetic field na penetrates sa isang daluyan na may mas mababang repraktibo index parameter sa isang distansya mas mababa sa 200 nanometers.

Ang unti-unting nawawala wave intensity ng liwanag ay magiging sapat na upang excite fluorophores. Gayunman, dahil sa kanyang labis na maliit na depth, dami nito ay napakaliit. Ang resulta ay isang mababang antas ng background.

pagbabago

Pag-ilaw mikroskopya ay batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni, ay maaring ipatupad sa epi-iilaw. Nangangailangan ito ng lenses na may mataas na numerical siwang (hindi bababa sa 1.4, ngunit ito ay kanais-nais na ito umabot 1.45-1.6), at bahagyang iluminado field patakaran ng pamahalaan. Ang huli ay nakakamit na may isang maliit na sukat spot. Para sa mas higit na pagkakatulad ng paggamit ng isang manipis na singsing, na kung saan ay hinarangan sa pamamagitan ng isang bahagi ng stream. Para sa mga kritikal na anggulo, kung saan pagkatapos, mayroong isang kabuuang pagmuni-muni, kailangan namin ng isang mataas na antas ng repraksyon ng immersion medium sa lens at ang takip na salamin ng microscope.